雙硫鍵分析

概述

如果編碼目標蛋白質的基因序列顯示為半胱胺酸 (cysteine)，指南要求確認所有游離巰基和雙硫鍵的數量及位置。
這部分可以使用胜肽圖譜分析 (還原條件與非還原條件)、質譜法或其他合適方法進行評估。
此處採用結合胜肽圖譜分析與質譜法的分析方法。這項方法需以蛋白水解酶 (例如胰蛋白酶) 在各種條件下分解目標蛋白質，並將生成的胜肽碎片分子量與理論值進行比較。下方為人類溶菌酶分析的測試流程及結果。

實驗流程

使用無細胞蛋白質合成試劑組 (Transdirect insect cell)，在試管中合成人類溶菌酶 (lysozyme)。(圖 1 為合成的人類溶菌酶胺基酸序列。)
使用親和管柱 (Strep-Tactin Superflow，德國 QIAGEN 製造) 進行純化。
使用 8M 尿素進行變性。
三種預處理後的樣品進行胰蛋白酶消化：未處理 (保留 S-S 鍵)；S-烷化作用 (烷化所有存在的游離 SH 基)；還原及烷化 (還原 S-S 鍵，接著烷化 SH 基)。

實驗結果

圖 1 顯示試管中合成的人類溶菌酶胺基酸序列及預測的雙硫鍵 (以直線表示)。表 1 為經胰蛋白酶消化之胜肽片段 (與雙硫鍵相關) 的理論值及 MS 量測值。

圖 2 顯示經胰蛋白酶消化之胜肽片段的部分質譜圖。

由於胜肽片段 B 的還原及烷化，m/z 3,239.22 離子消失，表示胜肽 3 及胜肽 4 形成分子內雙硫鍵 (圖 2)。利用相同方法也可以證實胜肽片段 C 的分子內雙硫鍵。(數據省略)

比較胜肽片段 A 還原/烷化與未處理
的質譜圖，表示胜肽 1 及胜肽 2
形成分子內雙硫鍵。然而，僅從圖 2
的結果無法確定與半胱胺酸的結合
情況。

為了證實此結合，使用 LC 鑑定
胜肽 1 的分子內雙硫鍵，以分離並
純化經另一種蛋白酶 (Thermolysin)
消化的胜肽片段 A，並確認該片段
的質量 (圖 3)。

圖3 胜肽片段 A 的Thermolysin消化產物 MS 質譜圖 (m/z 3,636.36)

表1 預測胜肽片段的理論值及量測值 (具有雙硫鍵)

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