單醣成分分析

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由於抗體藥物這類醣蛋白當中，是在蛋白質轉譯後，以多種酶的作用添加糖鏈，因此糖鏈結構的多樣性和不均勻，是無法避免的問題。依指南規定，必須測定醣含量 (中性糖 (neutral sugar)、胺糖 (amino sugars)、唾液酸 (sialic acid))。分析醣類成分通常使用示差折射率檢測器，不過抗體藥物中的醣類成分分析，則會使用靈敏度更高的螢光檢測。由於醣類本身不會發出螢光，因此在使用高效液相層析儀搭配螢光檢測器進行分析之前，會先以適當方法進行衍生化，使其具有螢光特性。

市售實驗室小鼠單株抗體分析

實驗及研究流程

  • 對小鼠單株抗體進行酶消化 (神經胺酸酶等)、水解、N 乙醯化 (N-acetylation)。
  • 使用 4-胺苯甲酸乙酯 (4-aminobenzoic acid ethyleste, ABEE) 將螢光標記添加至游離單醣的還原端。
  • 螢光標記後的單醣以 Prominence 進行 LC 分析。
    * 使用 Plus S ABEE 單醣成分分析試劑組 (日本 J-OIL MILLS, Inc. 製造) 對小鼠單株抗體進行預處理。

結果
含六種單醣及螢光標記混合物的標準樣品，使用 Prominence 進行分析，並依據面積值製做每種單醣的校正曲線 (圖 1 及圖 2)。

其次，經 60 μg (400 pmol) 小鼠單株抗體處理後得到的單醣混合物，取十分之一，以 Prominence 系統進行分析，計算每個單醣峰的面積 (圖 3)。

而後使用標準樣品得到的校正曲線，依據單醣峰的面積計算結果，計算 1 mol 單株抗體中每種單醣的含量。

表 1 列出此測試中每 1 mol 市售小鼠單株抗體的每種單醣含量。