轉譯後修飾分析 | 以質譜儀分析合成蛋白質的聚異戊二烯化

以質譜儀分析合成蛋白質的聚異戊二烯化

蛋白質轉譯後修飾分析，近年來日益重要。
蛋白質聚異戊二烯化是一種 C 端脂質修飾，在許多低分子量 GTP 結合蛋白中 (例如 Ras) 皆發現此修飾，已知對於蛋白質與細胞膜、蛋白質之間的交互作用，具有重要的功能。
以下說明一種有效的分析方法，使用 Transdirect 昆蟲細胞無細胞蛋白合成試劑組，搭配 MALDI-TOF 質譜儀進行蛋白質聚異戊二烯化分析。

蛋白質聚異戊二烯化：15 碳脂肪酸基 (15-carbon farnesyl grou) 或 20 碳四異戊二烯基異戊二烯 (20-carbon geranylgeranyl group)，由異戊二烯轉移酶轉移至接近 C 端的半胱胺酸 (cysteine) 殘基。(請參見下圖。)
脂肪酸轉移酶 (Farnesyltransferase, FTase) 或四異戊二烯基轉移酶 I (geranylgeranyltransferase I, GGTaseI) 識別出 C 端 Cys-Ali-Ali-COOH motif (其中 Ali 是脂肪族胺基酸)，並將脂肪酸基或四異戊二烯基轉移至半胱胺酸殘基，而異戊二烯焦磷酸鹽則做為供體。
我們以已知會發生四異戊二烯化之人源 RhoC (參與訊息傳遞) 為模式蛋白進行分析。

■ 測試流程

■ 結果
未加入異戊二烯焦磷酸鹽 (prenyl pyrophosphate)：
僅測得尿素甲基化 (carbamide-methylated) 的 C 端胜肽片段。
加入 FPP：
測得部分脂肪酸化的 m/z1174.75 胜肽。
加入 GGPP (包括基質混合物)：
測得四異戊二烯基化的 m/z1242.83 胜肽。

以上結果顯示，Transdirect 保留了異戊二烯基轉移酶，這種酶可提供蛋白質聚異戊二烯化所需的活性。搭配質譜儀分析，此方法能夠為異戊二烯化分析提供強大的工具。

Transdirect 昆蟲細胞 (無細胞蛋白質合成試劑組)

這個新型的無細胞蛋白質合成試劑組，是以昆蟲細胞培養製成，蛋白質合成能力優於兔網狀紅血球溶胞產物系統。此試劑組附有最佳化的反應緩衝液及表現載體，可輕鬆進行最佳的蛋白質合成測試。

MALDI-TOF Mass Spectrometry

AXIMA Resonance 為一款 MALDI-QIT-TOF 質譜儀，在蛋白質體與醣鏈分析上提供強大的支援。
其結合了四極桿離子阱 (QIT) 分析器與MALDI游離法，可進行 fmol 級 MSⁿ 分析。
這些特性除了提供分子量外，還提供結構資訊，使MALDI-QIT-TOF MS廣泛用於蛋白質組學，生物化學，製藥，醫學，合成化學和有機化合物的結構分析。