Nexera-e - 應用資訊
全方位二維液相層析儀
全力發揮二維正交分離系統的所有潛力，進行全面的二維分離
簡介
在過去十年中，為了處理許多天然和合成樣品的高度複雜性，對更強大和更具辨別力的分析技術的需求呈指數增長。
在這方面，多維 (MD-LC) 和全方位二維液相層析 (LCxLC) 系統的實施為含有數百個緊密沖提組份的高度複雜樣品提供了強化解析度。分離能力的提高源於多個固定相的組合，具有不同程度的正交性 (選擇性)。無論採用何種特定的分離技術，質譜儀 (MS) 的使用都為分析型 LCxLC 平台增加了一個維度，進而能夠可靠地鑑定和定量測定那些層析可能完全分離或未完全分離的化合物 (Stoll 等人，2007年；Dugo 等人，2008 年；Francois 等人，2009 年；Guiochon 等人，2009 年；Donato 等人，2012 年)。
採集、正交性、峰容量
現實世界樣品的巨大複雜性實際上對解析度提出了很高的要求，一方面對分離科學家提出了挑戰，另一方面對管柱和硬體製造商提出了挑戰。到目前為止，管柱技術的主要進步包括填料堆積、部分多孔顆粒、無機 - 有機混合物、整體式、高溫管柱、亞-2 微米顆粒和奈米級管柱。此外，高純度矽膠和新型鍵結相化學物質使 LC 管柱更加高度有效和可靠，開發能提高靈敏度、可靠度、最小譜帶擴散或超高壓操作的商業儀器，滿足最佳操作所需的性能。
儘管取得如此重大的進展，並且分析人員在充分利用這些發展的情況下為層析技術開發做出了相當大的努力，但在許多情況下所需的分離效率壓倒了任何單一管柱方法的能力。因此，很多工作都集中在 MD-LC 系統的開發上，尤其是在 LCxLC 模式下，目的在於獲得更高的峰容量，nc，也就是可被完全分離的溶質總數。
定義 LCxLC 的標準，大約是在二十年前提出 (Giddings J.C.，1990)。第一個標準要求是，樣品的每一部分都必須進行兩次不同的分離，即兩種分離機制必須是「正交的」。根據第二個標準，所有樣品組份應照原比例地通過兩個管柱到達檢測器。第三個基本要求是在第一維中獲得的分離不得受到損害。
可以通過仔細選擇具有不同選擇性的兩個維度來滿足正交性的需求，以獲得兩個維度的非相關滯留時間。因此，管柱選擇性是設計 MD-LC 系統的首要考慮因素。可以利用大量層析分離模式，提供廣泛的選擇性 (例如與大小、疏水性、電荷等相關性)。例如，離子交換層析 (IEC) 根據電荷分離組份，與逆相 (RP) LC 完全正交，後者根據疏水性進行分離；使用強陽離子交換 (SCX) 管柱，與 RP-LC 或離子對 (IP)-LC 併用是迄今為止最常用的用於胜肽分析的層析分離模式組合，電荷和疏水性可提供高度正交性。必須注意的是，通常第二維由 RPLC 組成，因為它與 MS 檢測的連接具有高度相容性。
除了選擇固定相外，還可以透過調整實驗參數來進一步調整分離的選擇性，例如：移動相組成和 pH 值、離子對試劑、沖提 (等度或梯度)、流速、溫度。
理論而言，如果兩個以上獨立的分離機制以連續方式組合，則峰容量值 nc 急劇增加；然而，這種理想情況很難實現，因為分離譜帶從一個維度低效轉移到另一個維度，導致已解析的化合物重新再混合 (Giddings, 1984; Giddings, 1987)。後來進行的理論和實驗工作顯示，為了防止第一維解析度的損失，每個第一維峰的採集點數應至少為三個 (Murphy 等，1998)。如果第一維對整個多維分離的貢獻很高，那麼這種必要條件就變得特別重要。同時，這種必要條件對非常快速的第二維分離或使用多個第二維管柱提出了要求。此外，介面死體積和管柱外峰擴散對分離度損失也有顯著影響。
更現實的是，峰容量的計算應考慮第一維採集率不足、選擇性相關性 (正交性) 和兩個維度的滯留窗口的影響，這通常不涵蓋整個梯度持續時間 (Gu 等人，2011 年) ; Liu 等人，1995 年；Camenzuli 和 Schoenmakers，2014 年)。
儀器配置和方法開發
研究人員在設計 LCxLC 系統時，實施了多種策略。分數從第一維到第二維的轉移可以在離線或在線上的模式下進行；這兩種技術都被廣泛採用，並且都具有不同的優點和缺點。
在離線方法 (LC/LC) 中，第一個層析步驟的餾份通過餾份收集器收集，通過揮發與溶劑分離，重新再溶解，然後重新注入第二個管柱。以移動相和緩衝液相容性、時間和持續時間方面等方面來說，這種方法擁有來自於任何分離模式可互相結合的極大靈活性優勢。分離能力可以通過每個維度的獨立最佳化來最大化，而靈敏度可以透過調節在兩個維度中注入的樣品濃度來調整。
主要缺點包括在溶劑揮發過程中潛在的樣品損失或降解、可能的樣品污染或人造合成的形成、自動化的困難等面向。此外，這些方法顯然更耗時，並且分析再現性低。當需要非揮發性緩衝鹽 (如 NaCl 或 KCl) 或大量有機溶劑來沖提第一個 SCX 維度中的胜肽時，透過第一次LC餾份收集後，接著才使用第二次 RPLC 分離的不連續離線方法，已有利地用於胰蛋白酶消化物的 LC/LC 分離 。
與離線方法相比，線上方法在技術上更具挑戰性且難以操作；另一方面，它們帶來了兩個分離維度之間全自動溶質轉移的巨大優勢，不會中斷流動。因此可提供更高的分析重複性。此外，減少的樣品處理使得處理不穩定化合物的操作更加可行並盡量減少損失，當處理有限的樣本數時，這是一個備受關注的議題。在開發線上 2D 方法時，必須考慮許多因素，因為更嚴格的要求使得不同分離模式的結合與所需的特定介面和軟體更加複雜。兩個維度中使用的管柱類型和尺寸、粒徑、移動相流速和組成都需要在相容性和 nc 峰容量方面進行最佳化。溶劑及/或溫度梯度的最佳化有助於在兩個維度上增加峰容量，而移動相組成 (沖提強度)、餾份體積和轉移頻率將最終影響第二維管柱前端的峰聚焦。
移動相組成和黏度也會產生過大的背壓並導致譜帶擴散現象。
大多數開發的線上 LCxLC 配置基於使用需求，配備了兩個裝有樣品定量環的兩相、10、8 或 6 通切換閥。兩個樣品定量環必須具有相同的體積，並交替填充第一管柱的沖提物；定量環尺寸取決於每次採樣週期的移動相體積，並且至少應等於單個餾份的體積。反過來，因為定量環內容物不斷地重新注入第二維管柱，採樣週期必須等於第二維分析所需的時間。由於這些原因，第二維分離需要快速，這一需求可以透過使用短管柱、填充小粒徑顆粒和迅速再平衡時間來實現。此類管柱通常在梯度條件下操作，以最大程度地減少環繞現象和峰展寬；然而，這種操作條件需要在每個分析週期結束時執行再平衡步驟，有時會導致更高的背景檢測雜訊，因為移動相成份會迅速改變。事實證明，使用整體式管柱和部分多孔顆粒或高溫分離對解決此類問題非常有幫助。兩種維度的層析均可在等度或梯度條件下操作；然而，為了避免兩個維度之間的參數設定不相容問題，必須使用窄孔或微孔主管柱以降低移動相互溶性和可能發生的溶劑強度不匹配，這兩者都會影響系統相容性。此類管柱通常採用的低流速也減少了譜帶擴散並有助於在 2D 管柱的前端進行有效的峰聚焦，這要歸功於移動相強度最小化，這與從 1D 到 2D 的轉移有關。相比之下，更寬的內徑管柱 (4.6 mm 內徑) 具有更高的樣品負載能力，但在兩個維度介面之前進行分流時，會導致樣品損失。或者可以在優化流速下執行，這種情況下的缺點是分離效率降低。
在所謂的「填充定量環介面」中，儲存定量環被填充有固定相的捕集管柱所取代；當第一個捕集管柱裝有一維沖提物時，在前一個循環中擷取的樣品組份從第二個捕集環中釋放出來，用於後續的二維分離。這種配置允許重新濃縮分析物，在進一步層析分析之前將其集中在捕集管柱上；因此，可以將窄樣品譜帶引入第二維管柱。由於捕集效率和快速沖提成反比，優化出令人滿意的參數方法需要在 1D 中使用弱溶劑，以實現高度有效聚焦，而在 2D 中需要強溶劑，以實現快速沖提。平行分析管柱可替代捕集管柱，配備單獨的樣品定量環。這樣的選擇對相同的滯留行為和效率提出了嚴格的要求，因為分析是對連續的餾份並行進行的，並且兩個結果層析圖要匹配以產生等高線圖。
在停流技術中，閥門用於連接兩根管柱，沒有任何儲存定量環或捕集管柱。每次切換閥門時，1D 中的流動都會停止，收集的餾份被轉移到 2D 中進行分離。2D 分離後，1D重新開始流動和分離，以提供新的餾份。與基於連續流的線上方法相比，這種類型的方法顯然需要更多時間，因此其使用僅限於僅需要收集有限數量的一維餾份的情況。
LCxLC-MS：能力和要求
設計線上 LCxLC-MS 技術時，必須仔細考慮檢測器感度和儀器有限的動態範圍。事實上，使用的管道和閥門可能會導致顯著稀釋並對 MS 響應產生負面影響，整體稀釋因子是每個維度中稀釋因子的乘積。使用捕集管柱進行餾份收集可以緩解這一問題，因為會發生分析物重新濃縮。
對第二個維度提出了更嚴格的要求，它代表 MS 系統之前的後段分離，涉及管柱類型、移動相組成和流速。逆相層析是最常見的選擇，因為逆相分離結束時的移動相含有高百分比的有機溶劑和揮發性添加劑，這對 MS 電灑游離是有益的。關於管柱尺寸，小型化 (使用內徑 1.0 mm 的微孔或內徑 0.1-0.5 mm 的毛細管) 在稀釋和靈敏度方面也有好處；此外，降低移動相流速 (μL 至 nL 範圍) 可避免在 MS 源之前分流。
另一種執行 LCxLC-MS 分離的簡單方法是直接連接兩個或多個具有正交選擇性 (通常基於 SCX 和 RP 材料) 的管柱，這些管柱串聯填充到單個毛細管中。透過一系列增加沖提強度的脈衝步驟從第一根管柱子沖提餾份，然後是連續梯度，用於從第二根管柱沖提分析物；後者可以直接與 ESI (電噴灑)/MS 系統連接。儘管這種雙相或三相固定相段可應用於線上配置，但由於MS而受限的相容性、再現性和靈活性議題，最小化峰擴散才能有利於MS直接檢測。
MS 檢測的高選擇性提供了強化的識別能力，可以區分未 (完全) 層析分離的化合物。質譜法允許使用同位素標記的化合物作為內標，以非常準確、精確和高靈敏度 (pg 級) 進行定量測定。與 UV 檢測器不同，MS 系統還可以用於非吸光性分析物，並且可以在全掃描模式 (TIC) 下執行，或者更具體地說，在串聯 MS (MS-MS) 實驗中或在選擇離子監測中執行 (SIM) 模式。SIM 操作是開發選擇性和靈敏的定量分析的首選，而使用軟式游離技術產生的串聯 MS 數據可提供有助於識別未知分析物的結構資訊 (Gross, 2004)。然而，在存在具有相同 m/z 值的高背景離子的情況下，在 SIM 模式下定量，甚至檢測目標微量組份可能很困難；在這種情況下，恆定中性丟失或母離子掃描技術有助於區分感興趣的離子與非特定基質成份，只需監測源自特徵碎片模式的那些 m/z 值。所謂的「選擇性反應監測」(SRM) 或「多反應監測」(MRM) 模式提高了選擇性並降低了檢測極限，進而減少了樣品消耗；此外，SRM 方法還可以透過減少清理程序的需要來減少分析時間。
因此，對實施 LCxLC-MS 系統的興趣是顯而易見的，但是需要解決許多要求和不相容性，這使得這兩種技術的串連成為一個複雜的問題。
第一個明顯的要求是介面，其主要目的是在分析物進入質譜儀的高真空之前去除移動相。其次，大多數適合 LC 分離的分析物是低揮發性、熱不穩定的化合物，因此不適合 CI 或 EI 游離。LC 泵必須是無脈衝的，以恆定流速輸送移動相，除了 LC 管柱內徑外，該泵還必須與所採用的介面類型相容；這種要求對於提供背景離子的穩定 TIC 基線是必要的。移動相參數，如表面張力、沸點和電導率，可能會影響介面的操作，以及移動相揮發過程中沉積在ESI探頭上的非揮發性緩衝液 (磷酸鉀或磷酸鈉) 添加劑。這些限制反過來又對第二維固定相的選擇造成了一些限制，逆相層析是一種流行且簡單的選擇。為避免對兩部獨立儀器的性能產生負面影響，LC-MS 介面應滿足多項要求，包括：高游離效率 (確保可向 MS 輸送大量樣品)；低化學背景 (以盡量減少對分析的干擾)；可重複的定量資訊 (低檢測極限下的寬廣動態範圍)；LC 性能不會下降 (尤其是對於多成份混合物)；不與分析物發生反應 (在轉移和進入 MS 時)；能夠在很寬的分子量範圍內產生離子。介面的操作應與廣泛的層析條件相容：移動相組成 (0 至 100% 水溶液)、緩衝液和添加劑 (不應發生沉澱)、移動相流速 (nL 至 mL min-1 範圍) 和梯度沖提。最後一項要求在 LCxLC-MS 平台中是強制性的，該平台通常用於實現複雜混合物的分離，其組份可能表現出廣泛的極性；因此，梯度沖提至少需可實施於兩種維度層析其中之一。在質譜儀方面，介面的操作顯然不應損害 MS 檢測器在真空要求、游離模式、掃描速率和解析度方面的全部功能。理想情況下，介面應該能夠為從 LC 系統沖提的任何組份產生質譜圖。與 GC-MS 相比，沒有一個 LC-MS 介面具有類似的功能。因此，嘗試將 LC 與 MS 結合造就了各種介面以及新的游離技術產生。
大氣壓游離 (API) 是第一種將 LC 與 MS 直接連接的技術，其次是熱噴霧 (TSP) 游離和粒子束介面 (PBI)。如今 CF-FAB、API、TSP、PBI、動帶等幾乎全部被 ESI、MALDI、大氣壓化學游離 (APCI)、大氣壓光游離 (APPI) 所取代。近年來，隨著適合與毛細管型 LC 管柱連接的介面的開發，LC-nanoESI 操作變得可行，在 μL 至 nL 流量範圍內操作。在樣品導入質譜時，nanoESI 執行直接注入模式，樣品在沒有事先分離的情況下通過進樣閥輸送到離子源；目前的配置使用鍍金毛細管或微流晶片，並允許分析物檢測低至 femto-莫爾水平，進而提高 LC-MS 技術的靈敏度。
在 LCxLC-MS 平台中，通常需要快速的 MS 採集速率，因為第二維分離可能非常快速，並且峰寬以幾秒以下為特徵的情況並不少見。為了對 2D 沖提物進行充分採樣，質量分析器應該能夠為每個峰採集至少 6-10 個數據點。與此同時，隨著介面技術的進步，舊的磁場式質譜儀已經被離子阱值譜儀、四極桿質譜譜儀和飛行時間質譜儀所取代。各種後來上市的串聯式質譜儀，其特點是高解析度、增強的靈敏度以及在寬動態範圍內提高的質量準確度；例如: 離子淌度 (ion mobility) TOF、四極桿 TOF (Q-TOF)、離子阱 -TOF (IT-TOF) 和線性離子阱 - 傅里葉變換離子迴旋共振 (FT-ICR)。目前市場上銷售的最先進設備的前所未有的準確度、速度和解析度，無疑使質譜在當今基礎研究和應用研究中發揮了核心作用。
四極桿質譜儀最常與 LC 或 LCxLC 結合使用，因為它使用簡單、成本相對較低且穩固耐用；然而，傳統的四極桿質量解析度低 (通常為 1 Da) 並且質量分析範圍有限。另一方面，最新一代單段四極桿質譜儀允許高速掃描和超快速電荷切換，以進行高速分析。必須強調的是，小尺寸和串聯式質譜儀的可行性使四極桿質譜儀成為桌上型 LC-MS 和 LC-MSn 應用的理想選擇。
TOF 質譜儀具有掃描速度高、質量解析度高 (使用反射器) 以及幾乎沒有質量範圍限制 (同時檢測質量範圍內的所有離子，無需掃描) 的優勢。無論是分析單一離子還是整個質譜，都能獲得最大靈敏度；此外，高質量解析度允許在鑑定未知化合物時精確的預測化學式。TOF 系統與離子阱 (IT-TOF) 或四極桿 (Q-TOF) 結合作為串聯式質譜儀實驗也是理想的選擇。
從定量的角度來看，線性動態範圍取決於所採用的游離源類型；ESI 的特點是動態範圍超過 2-3 個數量級，是目前常規 LC-MS 使用者在定量分析中最常見的選擇。然而，APCI 和 APPI 技術提供了更高的靈敏度和更寬的動態範圍 (4-5 個數量級)，儘管它們不能用於生物大分子。
參考資料
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適用的化合物類型
LCxLC 和 LCxLC-MS 技術可應用於多個研究領域。至今為止開發的大多數應用程式涉及蛋白質 (完整的或消化的)、食品、藥物、生物、有機和環境樣品。此外，合成物、天然聚合物和寡聚物也產出一些應用報告了。
完整和消化後蛋白質的 LCxLC
術語「蛋白體學」涉及細胞、組織或生物體液中蛋白質的表徵、鑑定和定量，還涉及蛋白質交互作用的測定，以執行給定的細胞任務，或作為許多疾病的關鍵參與者。使情況進一步複雜化的是，不同的環境、生物 (甚至個體)、藥理學和疾病因素最終會影響蛋白質表達，並確定統計學上的顯著變化。
傳統上，2D-GE 和 MS 鑑定一直處於該領域的前沿，因為它對完整蛋白質具有出色的分辨能力。然而，這種技術受到幾個缺點的影響，導致全方位液相層析儀與質譜儀併用在蛋白質組學研究領域發揮核心作用，作為替代凝膠分離方法更費力、不太全面的方案。
不同的分離模式已被開發用於在一維中提供廣泛的選擇性，例如強陽離子交換 SCX 或強陰離子交換 (SAX)、尺寸排阻層析 (SEC) 或親水交互作用液相層析 (HILIC)。相比之下，逆相層析與MS 相容性高而通常用於第二維層析。最常用的逆相是十八烷基矽膠 (ODS)，市售有多種管柱長、內徑、顆粒和孔徑，以及 pH 穩定性和疏水性。疏水交互作用是梯度條件下胜肽分離的原因，通常使用乙腈 (ACN) 作為有機改性劑，使用三氟乙酸 (TFA) 或甲酸 (FA) 作為離子對試劑。使用低百分比的有機溶劑可以同時進行有效的線上除鹽和胜肽濃縮，提供出色的 MS 相容性。
另一方面，完整的蛋白質難以處理，這使得它們的 LC 分離和隨後的 MS/MS 檢測非常具有挑戰性。另一方面，它們用蛋白水解酶 (通常是胰蛋白酶) 消化會顯著增加樣品的複雜性。因此，LCxLC 根據胜肽的電荷和疏水性改進了胜肽的分級分離，提高了游離效率，並降低了 MS 檢測之前的樣品複雜性。此外，從更豐富的物種中分離低濃度的胜肽，最終導致動態範圍的整體增加，凸顯典型的 MS 檢測問題，如離子抑制和取樣不足。
食品的 LCxLC
食品是包含有機和無機成份的複雜混合物；他們的分析通常針對食品安全和真實性的評估、製程技術的控制、營養價值的確定以及對人類健康可能有益或有害的分子的檢測。因此，食品化學最嚴格的要求之一是不斷改進和開發強大的分析技術，目的在分析食品樣品的主要成份以及次要成份。
為明確識別此類分子，LCxLC 與 MS 併用是一種有用的工具，尤其是在沒有商業標準的情況下。
開發並應用於食品化合物分析的 LCxLC 系統採用了 NPxRP、RPxRP 和 HILICxRP 分離模式的組合。在 NP 模式下，探討了兩種不同的分離方法：用極性無機填料 (通常是矽膠) 吸附和分配，其中極性有機相與硅膠材質鍵合，例如氰丙基 (CN) 或二醇基團。在 NPxRP 方法中，還可以考慮將銀離子層析與用於三醯基甘油分析的非水相反相層析 (SICxNARP-LC) 相結合的分配機制。另一方面，HILICxRP 和 RPxRP 配置使用不同的化學固定相已用於分析牛奶樣品中的磷脂和各種食品相關產品中的多酚。
藥物、生物、有機和環境化合物的 LCxLC
在過去的幾年裡，藥物越來越受到關注，主要關注藥物活性化合物的評估，以及它們與所有潛在雜質及/或降解產物的分離。藥物雜質可以歸類於法規監管的有機物、無機物和殘留溶劑，這些雜質來自原材料的改變，或合成中間體，或是在反應 (溫度、pH) 或儲存條件 (水解、氧化、開環、等)，產生的複雜混合物。出於這個原因，傳統的 LC-MS 系統在檢測此類雜質時經常失敗，因此需要更強大的替代方案，例如主要具有兩個維度的 RP 固定相的 LCxLC，與 MS 相結合，以進行明確的測定。
合成、天然聚合物和寡聚物的 LCxLC
液相層析是表徵聚合物分子的強大工具，後者在分子特徵 (如分子量、鏈結構、化學組成和功能) 方面具有多元分佈。聚合物的 LC 表徵可分為三種不同的模式：尺寸排阻、臨界條件和交互作用模式。尺寸排阻層析法是聚合物分子表徵中使用最廣泛的技術，因為它速度快、使用簡單且適用性廣泛。為了分析合成和天然聚合物和寡聚物，研究了 LCxLC 方法與 MALDI-TOF-MS 的結合。對於第一維，使用了不同的分離模式，即 NP-GPEC (正相梯度聚合物沖提層析)、LC-CC (臨界條件下的液相層析) 和 RPLC，而對於第二維，SEC 管柱具有在所有情況下都被使用。雖然 SEC 管柱上的聚合物分離完全基於分子量大小，但 LC-CC 技術根據聚合物的分子特性 (例如特定的組成或功能) 來分離聚合物。
使用 LCxLC 和 LCxLC/MS 的原因和用處
由於實際選擇了二維選擇性相關性低的分離系統，因此全方位液相層析是分析複雜食品樣品的可行工具。
在過去十年中越來越高的興趣可以追溯到即用型 LCxLC 系統的商業可用性，該系統配備了用於方法開發和數據處理的專用軟體，可用於定性和定量目的。進一步值得注意的改進將是開發具有非常細粒度的新型分離材料，例如亞-2 微米，以及能夠減少 2D 分析時間以提高樣品處理量並盡量減少傳統 (單維) 系統的靈敏度損失的分析方法的開發。為此，在 2D 中使用窄孔或微孔管柱可能有助於避免LC 系統在 MS 探頭之前流量分散，進而減少稀釋。
LCxLC 以及更大範圍內 LCxLC-MS 分析平台的實施可以極大地幫助解決許多重要問題：
- 實現更可靠的定量 (從基線分離的峰獲得可靠數據)
- 執行 (半) 製備分析 (純化收集感興趣的化合物以供進一步使用)
- 避免樣品萃取/純化步驟 (MS 提供了額外的分離/選擇性維度)
- 減少偽陽性 (在 MS 檢測之前以時間解析同量異位化合物)
- 允許進行已知和未知分析 (降低樣品複雜性並提高 MS圖譜的品質)