使用 Microflow LC/MS/MS 對超微量體積血漿樣品中的藥物進行高靈敏度分析
藥物及其他外源性物質，已知在體內通常會經過代謝，以進行解毒和排毒。因此，研究藥物在體內之代謝情形的藥物動力學 (PK)，是藥物開發的重要程序，包括臨床前和臨床試驗階段 (1)。在臨床前 PK 研究中，使用從動物實驗取得的生物樣品，以 LC/MS/MS 分析藥物及代謝物的濃度。
不過由於動物模型的體積限制，可安全採集的樣品量也有限，有時需要大量的動物和藥物才足以進行評估，造成動物倫理和成本方面的問題。要克服這些問題，一個有效的途徑是開發高靈敏度 LC MS/MS 分析法，搭配微量採樣技術，即可從少量的樣品檢測藥物。
本文舉例說明以高靈敏度的 MicroFlow LC/MS/MS 方法，分析超微量體積血漿樣品中的藥物。
Nexera Mikros™ Microflow 液相層析質譜系統
圖 1. Nexera Mikros™ Microflow 液相層析質譜系統
本研究使用 Shimadzu Nexera Mikros (圖 1) 進行，可有效應用於微流區到半微流區 (1 至 500 μL/min) 的各種流速。使用 Nexera Mikros 檢測目標成分，靈敏度高於常見的半微流 (semi-microflw) LC/MS 系統，流速範圍約為 100 至 500 μL/min，且相較於 nano LC/MS 系統 (流速範圍 100 nL/min 至 1 μL/min)，具有絕佳的穩定性，也可縮短分析時間。
圖 2 顯示捕集和沖提期間的流程圖。由於乙腈 (acetonitrile) 是去蛋白處理中常用的樣品溶劑，直接進樣的峰形隨著乙腈的溶析強度而變寬，因而限制了進樣量。為克服樣品溶劑造成的峰形變寬，Nexera Mikros 系統採用捕集和沖提進樣方法，先將目標化合物保留在捕集管柱後 (捕集)，再切換閥門，分析流動相逆沖洗管柱，將目標化合物運送至分析管柱 (沖提) 進行分離和檢測。
圖 2. 捕集和沖提系統流程圖
樣品製備
圖 3. Verapamil 及其代謝物 Nor-Verapamil 的化學式
加入 Verapamil 和 Nor-Verapamil 以製備血漿樣品 (2 μL) ，如圖 3 所示。之後，樣品中再加入 58 μL 沉澱劑溶液 (含有 0.1% 乙腈 (acetonitrile) + 甲酸 (formic acid) 和標記的內標準品 Verapamil-D6) 稀釋。樣品在室溫下靜置 20 min (反應)，然後進行離心，將上清液轉移至樣品瓶，進樣 5 μL 用於分析。
分析條件
表 1 及表 2 分別列出 Nexera Mikros 和 MS 的 HPLC 條件。使用含 0.1% 甲酸的水/乙腈 = 98/2，將樣品注入捕集管柱，並以含 0.1% 甲酸的水和乙腈梯度分離，進行分析。在分析過程中，將 100% 的乙腈輸送至捕集管柱進行清洗。另外，也使用相同設備配置，進行微流分析和半微流分析的比較。
評估 Microflow 分析中的訊號強度
血漿中加入 Verapamil 和 Nor-Verapamil (最低濃度校正點，0.5 μg/L)，評估微流分析對目標化合物訊號強度的影響。進樣體積調整至與管柱內線性速度相同，比較微流和半微流的訊號強度。使用 Micro-ESI 8060 微流離子化單元，做為微流條件下的游離源，半微流條件下則採用標準 ESI 游離源。表 3 列出分析條件。
本文說明的產品尚未獲得日本藥品及醫療器材法的製藥裝置核准或認證，不得用於醫學檢查及治療或相關程序。相較於半微流分析，使用微流時，Verapamil 的訊號強度增加 4.5 倍以上，而 Nor-Verapamil 的訊號強度增加 3.5 倍以上 (圖 4)，證實相同的樣品體積可使用微流分析法而提高靈敏度。
圖 4. (a) Verapamil 及
(b) Nor-Verapamil 在微流和半微流 LC/MS/MS 分析中的訊號強度比較
(處理後的血漿樣品濃度 0.5 μg/L)