Erexim™ Application Suite

單個醣基化位點Glycan的異質性簡化分析

一般而言，利用蛋白質上分離Glycan來分析N-linked glycans是最常使用的方式。儘管這種方法在定量和定性方面都是準確的，但給出的結果是來自所有可能的glycoproteins和醣基化位點的Glycan的平均圖。為了專注在，需要使用在glycopeptide水平的enzymatic protein進行digest分析。但是glycopeptide具有十分獨特的質量，分析數據需要花許多時間來進行資訊分析和密集的手動數據操作。Erexim™ Application Suite 可自訂即用型的方法和自動數據分析，來協助特定發生糖基化位點的glycans異質性分析。

什麼是 Erexim™ (Energy-resolved oxonium ion monitoring) ？

當通過 MS/MS 分析glycans或含glycan的分子時，通過碰撞產生的低 m/z子離子提供glycan衍生離子資訊的數量，稱為oxonium離子。儘管oxonium離子的種類和數量可以用來判斷glycan的結構，但一般的MS/MS分析 無法提供的充足的特徵來區分glycan結構。 Energy-resolved oxonium ion monitoring ，縮寫為 Erexim™，利用一系列碰撞能量 (CE) 碎裂來擷取數據，為 MS/MS 數據增加了另一個維度的豐富度。 oxonium離子數量相對於 CE 的變化圖，Erexim™ 檔案，包含分辨相似聚醣結構的能力。Erexim™ 需要使用具有超快的掃描速度的三重四極桿質譜儀，來獲取大量數據，並獲取可重現輪廓的定量能力。此外，Erexim™ 中產生的子離子，對 N-linked glycans核心結構具有特異性，成為相對定量glycan結構報告的理想離子。

Reference: A Toyama. et al., Anal. Chem. 2012, 84, 9655−9662

可自訂的Glycan結構資料庫 - Profile Database Manager

Erexim™ Application Suite 的資料庫包含 45 個 N-linked glycans結構清單。每個清單條目都包含Glycan組成、連鎖資訊、胺基酸序列 (如果是glycoproteins) 和參考 Erexim™ 配置檔案。客戶可以添加清單以隨時瞭解研究進展。

Glycan結構操作

成分的詳細定義

可以輸入資訊馬上轉換為適用的方法 - MRM Method Maker

對於詳細的定量分析以及 Erexim™ 剖面數據擷取，MRM 離子對的數量可能是數百個，正確整理它們非常費力。MRM Method Maker 會根據感興趣的glycans結構、胜肽序列、離子加合物類型和其他輸入的資訊，自動生成 MRM 離子對。MS 儀器參數，如 CE、停留時間等，也可以同時進行統整分配。

設定 MS 擷取參數

選擇分析對象

數據分析-自動圖形化的數據表示

由於glycans和glycopeptides在 LC/MS檢測中，會呈現多種電荷狀態，所以定量需要處理複雜的資料才能正確組合來自每個分子種類的所有離子。自動執行數據分析，以圖形方式呈現結果，可以是相對數量的條形圖，也可以是 Erexim™ 剖面圖。

相對數量條形圖 (左) 和 Erexim™ 剖面圖 (右)

Erexim™ 應用套件——從glycans分析到數據呈現

* 從 LabSolutions 的主頁上執行。

第 1 步： Glycan異質性分析 (定量分析)

MRM 分析工作流程

第 2 步：Erexim™ profiling擷取 (定性分析)

Erexim™ 分析工作流程

分析市售的IgG glycopeptide

以下是 Erexim™ Application Suite 分析N-glycan異質性的範例。分析市售單株抗體 Fc region的glycosylation位點，利用50 μg胰蛋白酶消化抗體溶液來製備樣品2 個小時，反應後混合物用 Supel-Select HLB SPE 管柱來去除疏水性胜肽和殘留的胰蛋白酶，豐富Fc region glycopeptides則流過SPE。

(1) 使用 MRM Method Make來選擇感興趣的glycans結構，同時進行glycans列表。

(2) 輸入 MS 儀器參數，例如停留時間、暫停時間、CE，將列表化合物轉換為 MRM 離子對。CE 值可以自動化的填入最佳值。

(3) 將步驟 (2) 中生成的 MRM 離子對列表保存為方法檔，用 LCMS-8060 進行三次重複量測分析。

管柱:	AerisPeptide XB-C18 2.1 x 150 mm (Phenomenex)
移動相 A:	0.1% Formic Acid
移動相 B:	90% Acetonitrile / 0.1% Formic Acid
梯度層析:	2%B (0-2 min) – 30%B (10 min) – 98%B (11-12 min) – 2%B (12-15 min)
流速:	0.3 mL/min
進樣量:	10 μL

MRM 圖譜

(4) 使用 LabSolutions 積分分析峰後，將保存的數據上傳到數據分析軟體中。自動生成下面的顯示結果。

N-linked glycans結合IgG Fc region的比率圖
(Fc region的胺基酸序列：EEQYNSTYR)

N-linked glycans比例

(5) 使用 MRM Method Maker，選擇Glycan結構 ID 45100 和 44100 作為 Erexim™ 的分析目標。利用碰撞能量 (CE) -10 -130 V 的範圍，每個間隔為 10 V。

(6) 將步驟 (5) 中生成的資訊存檔在 LabSolution Method File，用 LCMS-8060 進行三次重複量測分析。

管柱:	AerisPeptide XB-C18 2.1 x 150 mm (Phenomenex)
移動相A:	0.1% Formic Acid
移動相B:	90% Acetonitrile / 0.1% Formic Acid
梯度層析:	2%B (0-2 min) – 30%B (10 min) – 98%B (11-12 min) – 2%B (12-15 min)
流速:	0.3 mL/min
進樣量:	10 μL

MRM 圖譜

(7)使用 LabSolutions 積分分析峰後，將保存的數據上傳到數據分析軟體中。右側顯示Erexim™ 剖面圖的生成結果 。

Erexim™ profile plot for Glycan ID 44100 (left) and ID 45100 (right)

(8)與顯示在參考資料庫中記錄的 Erexim™ 圖比較，新獲得的數據相似於相同glycan質量的參考數據，顯示從樣品中檢測到的數據與glycan ID 45100_ER_Ch3 結構相同。另外，所獲得的glycan ID 44100 數據不同於具有相同glycan質量的44100a_ER_Ch3 和 44100b_ER_Ch3兩個參考圖譜。將所擷取數據中m/z204的 離子產物曲線放在兩個參考曲線之間，為研究人員提供了有關樣品成分的重要資訊。

glycan ID45100 的 Erexim™ 曲線圖的比較
(左圖：獲取的數據，右圖：獲取的數據疊圖到參考圖上)

同樣地，獲取的數據 (左) 和兩個參考圖的疊圖 (右)